人多能干細胞培養基

Human PSC Medium

一、產品基本信息

二、產品簡介

人多能干細胞培養基是一款無外源動物成分、 化學成分明確且適用于無滋養層培養的人多能干細胞培養基。該產品適用于 Essential 8 系統培養的干 細胞，可應用于干細胞傳代，內含干細胞保護因子，防止細胞的凋亡、分化，對細胞具有良好的保護作 用。本產品生產過程遵循 ISO9001 體系,并符合 GMP 指導原則。

三、產品特性

? 無需滋養層細胞。

? 成分明確，批間差小。

? 適用于 Essential 8 系統培養的人多能干細胞。

? 無外源動物成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風險。

四、產品內容

五、相關產品

即用型基質膠（Applied Cell?: AC-1001007） 人多能干細胞消化液（Applied Cell?: AC-1001008） ES/iPS 細胞凍存液（Applied Cell?: AC-1001012）

六、實驗準備 人多能干細胞培養基配制

1） 2-8℃解凍人多能干細胞-添加劑，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲 存于-20~ -80℃，避免反復凍融；

2） 按 1:50 的比例將人多能干細胞-添加劑（10mL）加入到人多能干細胞-基礎培養基(500mL)中，混合 均勻即成為人多能干細胞培養基?；靹蚝蟮娜硕嗄芨杉毎囵B基可在 2-8℃ 穩定儲存 2-3 周，不 建議使用配制已超過 3 周的人多能干細胞培養基。

3） 實驗試劑平衡：人多能干細胞培養基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。 注意：培養基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。

七、操作方法(以下步驟皆應在無菌條件下操作) hPSC 細胞復蘇

1. 實驗操作步驟：

1.1. 基質膠包被培養板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質膠（AC-1001007）， 輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使基質膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養箱中孵育 1h~2h，實驗前拿出并置于 超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時不用，可用 Parafilm 封口后 2-8℃ 儲存，并 于 1 周內使用。

注意：①一支凍存的干細胞的數量在 1×106cells/mL 左右，對應 6 孔板 1 孔；②即用型基質膠對溫度 敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質膠液面所及的瓶身，影響基 質膠質量。

1.2. 先將 2~3mL 的干細胞培養基加入 15mL 離心管中備用。

1.3. 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動，使其在 1~2min 內快速解凍； 注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4. 離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細胞培養基的 15mL 離心管中，將 15mL 離 心管置于低速離心機中配比平衡后，1200rpm 離心 3min；

1.5. 重懸：離心后棄上清加 1mL 人多能干細胞培養基對干細胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸 3~5 次左右。

1.6. 接種：吹吸均勻后，將已經平衡好的即用型基質膠棄掉，將吹打均勻的干細胞懸液加入到已經包被 好的 6 孔板中，并補全每孔 2mL 培養體系。

1.7. 培養：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細胞密度以及細胞團塊大小，呈 4 個 細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使細胞均勻分布。并置于 37℃，5% CO2 的恒溫培養箱培養，第 2 天觀察細胞貼壁情況；

1.8. 換液：從復蘇的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應及時更換新鮮培養基。

八、hPSC 細胞傳代

2. 實驗具體操作步驟：

2.1. 清洗：吸掉原有培養基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；

2.2. 消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于 37℃培 養箱中 2~5 min；

注意：消化時間依據干細胞生長密度，消化時間略有不同，根據經驗一般建議時間 2-5min。消化過 程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內部細 胞間出現間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3. 吹打：吸掉消化液后，加入 2mL 人多能干細胞培養基，用移液槍扇形吹打培養皿底，輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細胞集落脫落，并將其并轉移到 15mL 離心管中；

注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細胞。 如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正?，F象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。

2.4. 離心：1200rpm 離心 3min； 接種：棄上清，用干細胞培養基吹打細胞 5-10 次，吸掉包被培養板中的基質膠，并將細胞懸液加入 到培養板中，且補全每孔 2mL 的培養體系。

注意：吹打細胞要溫柔，并且吹打次數不要超過 10 次，并且

2.5. 換液：從傳代的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應及時更換新鮮培養基。

九、hPSC 細胞凍存

3. 實驗具體操作步驟：

3.1. 清洗：同 2.1；

3.2. 消化：同 2.2；

3.3. 吹打：同 2.3；

3.4. 離心：同 2.4； 重懸：離心后棄上清，加入 2 mL 無血清干細胞凍存液（AC- 1001012）對干細胞沉淀進行吹吸混勻， 吹吸 3~5 次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.5. 記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。

3.6. -80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。 注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.7. 液氮凍存：24 小時后將-80℃冰箱中的細胞轉移至液氮中長期凍存。

十、細胞形態圖

十一、質量控制